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Journal of Korean Research Association for Purple Bammboo Salt
Vol. 1. No.1.( 49～55 ) 2003
죽염혼합물이 Streptococcus mutans의 성장 및
산 생성에 미치는 영향
유용욱, 유현희
원광대학교 치과대학 구강생화학교실
Effects of Bamboo Salt and Bamboo Salt Mixture on the growth, acid production of Streptococcus mutans
Yong-Ouk You, Hyeon-Hee Yu
Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Wonkwang University, Iksan, 570-749
Abstract
We studied the inhibitory effect of the bamboo salt mixtures (Bams) on the growth and acid production of Streptococcus mutans (S. mutans). The growth of S. mutans was reduced by the presence of the Bam A (1mg/ml), Bam B (1mg/ml), Bam C (1mg/ml), and NaCl (1mg/ml) significantly
[숨은설명:시작]
Matsumoto M, Minami T, Sasaki H, Sobue S, Hamada S, Ooshima T. Inhibitory effects of oolong tea extract on caries-inducing properties of mutans streptococci. Caries Res. 1999;33(6):441-5.
[숨은설명:끝]
, and the positive control group (1% of NaF) also exhibited antibacterial activity. However, the bamboo salt alone did not exhibit antibacterial activity significantly. The decrease of pH was significantly inhibited in the presence of Bam A (1mg/ml), Bam B (1mg/ml), and Bam C (1mg/ml) compared to the control group
[숨은설명:시작]
박사논문-cell proliferation
[숨은설명:끝]
. The decrease of pH was also inhibited in the presence of positive control group (1% of NaF), but the Bamboo salt alone did not demonstrate the inhibitory activity. These results suggest that Bams may have inhibitory effect on the growth and acid production of S. mutans
Keywords : bamboo salt; bamboo salt mixture; Streptococcus mutans
♯To whom all correspondence should be addressed
Tel: 82-63-850-6926 Fax:82-63-850-7313
E-mail:hope7788@wonkwang.ac.kr
치아우식증은 치과영역에서 가장 흔한 만성질환으로 알려져 있다. 치아우식증은 법랑질, 백악질, 상아질등과 같은 아의 경조직이 점차 비가역적으로 파괴되는 질환으로서 일반적으로는 충치라고 알려져 있다(1).
치아우식증은 전 세계적으로 널리 만연된, 사람이 치아를 사람이 치아를 상실하는 대표적인 원인질환으로서 당섭취 증가와 평균수명이 늘어남에 따라 발생이 증가하는 추세이므로 그 효과적인 관리대책이 절실히 요구되고 있다(2-4). 치아우식증의 주된 원인은 치면세균막에 의하여 유발되는데, 치면세균막에는 많은 함량의 미생물이 존재하는 것으로 알려져 있다. 치면세균막내 미생물은 당질을 대사하여 유기산을 형성함으로 치아의 경조직을 파괴하는 것으로 보고된 바 있다. 치아우식증은 전 세계적으로 널리 만연된, Streptococcus mutans (S. mutans)는 치면세균막형성에 가장 중요한 역할을 하는 원인균으로 알려져 있으며, S. mutans는 치아우식을 일으키는 주요 원인균으로 주목받고 있다(5,6). S. mutans는 G(+) 통성 혐기성세균으로 구강내의 치면세균막에 상주하여 섭취한 음식물에 포함된 탄수화물, 특히 포도당, 과당 등을 분해하고 그 대사과정에서 발생하는 부산물인 유기산 주로 젖산을 세포외로 방출함으로써 치아 법랑질을 탈회시킨다(7).
치아우식증 예방을 위해 치면세균막 형성의 원인균을 퇴치에 penicillin과 erythromycin 같은 항생제가 효과적인 역할을 하는 것으로 보고된 바 있지만, 장기간의 사용시 항생제에 대한 내성이 발생하므로 인해 임상에서 사용되지 못하고 있다(8). 또한 불소 화합물의 이용법(9-11)도 치면세균막 형성 억제에 쓰이고 있으나, 80 ppm이상의 농도로 사용시 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있다(12). 그 외 몇몇 구강세정제 등이 치아우식예방을 위한 약제로 개발되어 왔으나(13), 아직까지도 치아우식증이 주요한 치아상실의 원인으로 부각되는 것은 이러한 약제들이 충분한 효과를 거두지 못하고 있다는 증거이다. 따라서 보다 효과적이고, 실용적이며, 안정성이 있는 치아우식증 예방제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
지금까지의 연구에 따르면 몇몇 천연물이 치아우식증 예방에 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다. 죽염은 치아우식증 예방에 효과적인 천연물로 전통의학에서 널리 사용되어 왔고, 현재에도 세치제 및 구강세정제로 사용되고 있는 형편이다. 또한 송진, 죽엽, 프로폴리스 및 자이리톨도 구강질환 예방제로 쓰여왔다.
따라서 본 연구에서는 죽염 및 송진, 죽엽, 프로폴리스 또는 자이리톨이 함유된 죽염혼합물이 S, mutans의 성장 및 산생성 억제에 미치는 효과를 관찰하여, 전통의학에서 치아우식증 예방에 사용되어온 죽염 및 죽염복합물의 효능을 과학적으로 입증하고, 더 나아가서 치아우식증에 예방에 사용되고 있는 기존의 방법을 보완할 수 있는 치아우식증 예방제를 개발시도 하고자 한다.
실험재료 및 방법
균주 및 배양
본 실험에 사용한 균주인 Streptococcus mutans ATCC 10449로, Brain heart infusion (Difco, USA)액체배지에 1-2차 계대배양 후 같은 배지에 식균하여 37℃의 항온기에서 24시간 배양하여 사용하였으며, 각 균주 배양액의 탁도를 탁도0.5관 (McFarland 0.5)으로 맞춘 다음 사용하였다.
죽염혼합물의 준비
효과적으로 항균 활성을 나타내는 죽염혼합물을 탐색하기 위하여 송진, 죽엽, 프로폴리스 또는 자이리톨을 이용하여 죽염혼합물 A, B, C를 제조하였다. 죽염혼합물 A의 조성은 죽염 55%, 송진 35% 및 자이리톨 10%가 함유되었고, 죽염혼합물 B의 조성은 죽염 66.7%, 송진 33.2% 및 죽엽 0.1%가 함유되었으며, 죽염혼합물 C의 조성은 죽염 55%, 송진 35%, 자이리톨 14% 및 프로폴리스 1%가 함유되었다.
항균 활성 측정
죽염 및 죽염혼합물 등의 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지(1% Glucose 함유)에 죽염 및 죽염 혼합물, NaCl, 등을 1 mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후 시험관에 0.95ml씩 분주한 다음 S. mutans를 0.05 ml 넣은 후, 37oC incubator에서 24시간 배양한 후 spectrophotometer로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세균 배양액을 연속희석하여 MSBA 고체배지에 도말한 후 37oC incubator에서 48시간 배양후 colony forming unit(CFU)를 계산하였다. 이때 1% NaF를 양성 대조군으로 사용하였다.
산 생성량 측정
죽염 및 죽염혼합물 등의 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지(1% Glucose 함유)에 1 mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후 시험관에 0.95ml씩 분주한 다음 S. mutans를 0.05 ml 넣은 후, 37oC incubator에서 24시간 배양한 후, pH meter를 이용하여 pH를 측정하였다.
실 험 결 과
죽염 및 죽염혼합물의 항균활성
죽염 및 죽염혼합물의 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지(1% Glucose 함유)에 각 시료를 1mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후 24시간 배양하여, 흡광도를 측정한 결과, 죽염혼합물 A, B, C, NaCl, NaF는 대조군에 비해 유의적인 차이를 보였고(p<0.01～0.001), 죽염은 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 측정된 OD값은 대조군에 대한 상대 성장률로 산정한 결과 죽염 99.30%, 식염 61.97%인 반면 죽염혼합물 A, B, C는 각각 5.21%, 2.16%, 9.51%로 S. mutans의 성장을 현저하게 억제되었다(Table 1).
Table 1. Effect of bamboo salt mixture on optical density of S. mutans ODa % of controlControl0.59±0.007 A (1mg/ml)0.03±0.006**C 5.21±1.12**B (1mg/ml)0.01±0.02** 2.16±3.05**C (1mg/ml)0.06±0.005** 9.51±3.13**Bamboo salt (1mg/ml)0.58±0.006 99.30±1.00NaCl (1mg/ml)0.36±0.007* 61.97±1.39*1% NaF0.004±0.005** 0.70±0.78**aOptical Density at 540 nm, Values are expressed as the mean±SD, (n=10).
*p<0.01 Significantly different from control group by t-test
**p<0.001 Significantly different from control group by t-test
MSBA 고체배지에 도말한 후 37oC incubator에서 48시간 배양후 colony forming unit를 계산한 후, 대조군에 대한 상대 성장률로 산정한 결과, Table 1과 마찬가지로 죽염혼합물 A, B, C의 1mg/ml 농도에서 S. mutans의 성장 억제 효과가 현저하였다(Table 2).
Table 2. Effect of bamboo salt mixture on colony forming unit of S. mutans CFUa % of ControlControl1.60×108±0.26A (1mg/ml) 0±0.00* 0±0.00*B (1mg/ml) 0±0.00* 0±0.00*C (1mg/ml) 0±0.00* 0±0.00*Bamboo salt (1mg/ml)1.44×107±0.08* 8.99±0.55*NaCl (1mg/ml)1.03×105±3.42* 0.06±0.02*1% NaF2.20×10±8.16* 0.01±0.00005*aColony forming unit, Values are expressed as the mean±SD, (n=10).
*p<0.001 Significantly different from control group by t-test
죽염 및 죽염혼합물의 산생성 억제효과
S. mutans에 의해 생성되는 유기산은 치아우식증에 직
접적인 영향을 미치는 중요한 요인이다. Table 3의 결과를 보면 죽염혼합물 A, B, C 및 양성대조군인 NaF처리군에서 S. mutans의 산 생성이 유의적으로 억제됨을 알 수 있었다. 그러나 NaCl 및 죽염 처리군에서는 산생성 억제효과가 나타나지 않았다.
Table 3. Effect of bamboo salt mixture on acid production by S. mutans SamplepHaControl3.98±0.09A (1mg/ml)7.14±0.06*B (1mg/ml)7.15±0.06*C (1mg/ml)7.11±0.07*Bamboo salt (1mg/ml)3.94±0.10NaCl (1mg/ml)3.96±0.111% NaF7.03±0.02*aValues are expressed as the mean±SD, (n=10).
*p<0.001 Significantly different from control group by t-test 고 찰
치아우식증은 구강 내에 생존하는 200여종의 미생물 중 S. mutans를 비롯한 구강질환 유발균들이 생성하는 불용성글루칸과 미생물들 그리고 음식물 잔사등이 서로 엉켜, 치면에 치태라고 하는 치면세균막을 형성하고 이들 미생물들의 대사산물인 각종 산에 의해 구강내 pH를 5.5이하로
낮추어 치아의 법질층의 무기질 성분들이 탈회되어 발생하는 질환이다2). 1980년대 중반부터는 전통약제나 식물 등에서 치아우식을 억제하는 효과를 밝히려는 일련의 시도들이 있어 왔다. 이에 본 연구에서는 죽염 및 송진, 죽엽, 프로폴리스 또는 자이리톨이 함유된 죽염혼합물의 S. mutans에 대한 성장과 산 생성 억제 효과를 측정하였다.
그 결과를 보면 A(죽염:송진:자이리톨=55:35:10), B(죽염:송진:죽엽=66.7:33.2:0.1), C(죽염:송진:자이리톨:프로폴리스=55:35:14:1), 죽염, NaCl 각 시료를 1mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후, S. mutans를 24시간 배양하여, 흡광도를 측정한 결과, A, B, C는 대조군에 비해 각각 5.21%, 2.16%, 9.51%의 상대 성장률을 보여, S. mutans의 성장을 현저하게 낮추었다(p<0.01). 반면, 죽염은 99.30%, 식염은 61.97%였다. 그리고, MSBA 고체배지에 도말한 후 48시간 배양 후 colony forming unit를 계산한 결과에서도 A, B, C는 1mg/ml 농도에서 S. mutans의 성장이 완전히 억제 되었으며(p<0.001), 식염과 죽염은 각각 8.99%, 0.06%의 상대 성장률을 보였다.
일반적으로 미생물 배양시 각 미생물은 탄소원을 자화하여 성장에 필요한 에너지와 중간대사산물로 이용한다. 이 과정에서 유기산이라는 노폐물이 축적되어 배지의 수소이온농도를 증가시키고 즉 pH를 떨어뜨린다(2). 특히 S. mutans에 의해 생성되는 유기산은 치아우식증에 직접적인 영향을 미치는 중요한 요인인데, 대조군에서 pH는 3.98인 반면, 죽염혼합물 A, B, C 첨가군에서 각각 7.14, 7.15, 7.11로 나타나 S. mutans의 산 생성이 유의적으로 억제되었으며(p<0.001), 이것은 양성대조군인 1% NaF처리군의 7.03과 비슷한 결과였다. 이에 비해, 죽염과 식염은 각각 3.94, 3.96으로 나타났다. 즉, 죽염혼합물첨가로 S. mutans의 성장 뿐만 아니라 대사과정이 억제되어 산 생성량이 감소된 것에 기인한 것으로 보인다.
식염이 세균에 대해 증식을 억제하거나 살균 효과를 나타내는 것은 주로 삼투압의 작용에 의한 것이라고 볼 수 있다(14). Takada와 Fukushima(15)는 2% 식염 농도에서 다종의 S. mutans의 증식은 억제되었으나, 치태형성에 관여하는 효소인 glucosyltransferase activity는 균 종류에 따라 서로 다른 결과를 가져 왔다고 하였다. 정(16)은 자당 용액에 저농도(2.7%)의 식염을 첨가한 경우 S. mutans에 의한 자당발효에는 영향을 미치지 않았으나 증식을 상당히 억제 하였다고 하였다. 죽염은 식염(천일염)을 대나무 속에 넣어 고온으로 가열하여 태우기를 여덟 번 반복한 후, 마지막으로 아주 고온으로 녹여 흘러내린 것을 빻아서 제조한 일종의 가공식염으로서(14), 금속원소 중 K, Ca, Fe, Zn, Mn의 함량이 높을 뿐 아니라 알칼리성(pH 10) 물질이다(17). 이러한 죽염은 우리나라에만 특이하게 전해되어 오는 민간요법으로 구내염, 치통, 설암, 구강암 등 구강질환 치료와 위염, 위산과다, 위궤양, 위암, 축농중, 중이염 등 매우 다양한 질환의 치료에 이용되었다(16). 또한 구강내 세균증식을 억제시키며, 치태억제 및 치은염 감소에 효과가 있다(14,18-22)고 보고 되고 있으며, 허 등(17)은 마늘-죽염 제제가 위장 장애에 대한 방어효과와 치료효과를 나타내었다고 하였다. 그러나 양 등(23)은 실험동물에서 항암, 항고혈압 및 항당뇨 효과를 나타내지 않았으며, 김 등(24)은 항위궤양 효과를 기대하기 어렵다고 보고하였다. 죽염의 경우에는 균 증식을 억제함에 있어서 삼투압 이외에 제조과정에서 첨가된 무기이온의 상호작용 및 높은 pH도 상당한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(16). 그러나 본 연구에서는 식염과 죽염을 각각 단독으로 사용한 것에 비하여 송진, 죽엽, 자이리톨 및 프로폴리스를 혼합한 것이 월등히 효과가 좋은 것으로 나타나 이러한 물질의 상호작용에 의한 억제 효과가 있는 것으로 보인다.
송진은 소나무와 같은 속 식품의 줄기에서 나오는 진으로 많은 양의 수지산과 α-피텐, β-피넨, 캄펜과 같은 정유, 쓴맛 성분인 피니피크린, 탄닌, 비타민 등이 들어있다(25). 동의보감(26)에는 모든 악창(惡瘡), 두양(頭瘍), 백독(白禿), 개소(疥瘙)를 주로 치료하고 사기(死肌)를 없애며 귀가 먹은 것과 충치를 치료한다고 기록되어 있다. 의방유취(27)에는 벌레가 먹은것처럼 이가 삭아 구멍이 생기면서 아픈 것을 치료하는데 쓰이며, 동약법제, 북한동의보감에는 염증, 악창, 옴, 습진 등 외용약으로 사용하였다고 한다(25,28).
죽엽은 대나무의 잎을 가리키며 열내림, 피멎이약, 중풍, 고혈압 등에 민간 요법으로 사용되어 왔고(29), 살균 및 항진균 작용과 항암효과, 지질과산화물 억제, 전자공여능, 아질산염 제거능 등의 생리활성도 있는 것으로 알려지고 있다(30).
그러나 송진과 죽엽의 치아우식 및 치의학 분야에 대한 연구 보고는 미흡한 실정이다. 본 연구에 의하면 죽염, 송진, 죽엽의 혼합물이 다른 혼합물에 견주어 볼 때 그 효과가 떨어지지 않는 것으로 보아 추후 송진과, 죽엽 각각의 연구도 필요하리라 생각된다.
프로폴리스는 꿀벌이 식물로부터 수지(樹脂)를 수집하고 이를 저작(詛嚼)하는 동안 분비한 타액과 복부로부터 분비되는 beewax를 섞어 만드는 물질이다(31). Propolis용액은 S. mutans와 구강에서 분리한 다른 세균에 대해 항균효과를 나타내어 치아우식을 억제한다(32)고 연구되고 있다. 현재 북구와 동구권에서는 프로폴리스의 항균, 방부, 수렴, 정균, 진경, 소염, 마취효과 등 그 동안의 연구 결과에서 나타난 효과들을 이용하여 치약성분, 화장품, 건강식품 등으로 광범위하게 이용하고 있다(33,34).
자이리톨은 식물에서 추출한 D-xylose를 수소화하여 생산하는 5탄당 알코올로, 자당과 같은 정도의 단맛을 내는 물질로서, 용해열이 커서 구강상쾌감을 나타낸다. 자이리톨은 40개국 이상에서 식품첨가 감미료나 미용제 또는 약제로 사용되고 있다(35). 구강내 세균에 대한 자이리톨 연구를 보면 이 등(36)
[숨은설명:시작]
김윤정, p15
[숨은설명:끝]
은 S. mutans를 100 mM 자이리톨이 첨가된 BHI에 배양했을 때 균 성장은 포도당, 과당 또는 솔비톨을 첨가하고 배양했을 때에 비해 1/2정도 억제 되었고, 배양물의 pH 저하 등 자이리톨이 첨가된 BHI 배양액에서 가장 낮게 나타났으며 포도당과 함께 배양했어도 자이리톨이 첨가되면 균 성장과 pH 저하도 자이리톨의 영향으로 억제 되었다고 보고하였다. 또한 박(37)은 자이리톨(0.5%)이 S. mutans에 의해 8시간 동안에 우식임계 pH 5.5에 도달되지 않았으며, S. mutans의 성장을 저해하였다고 하였다. 또한 자이리톨과 불소의 복합작용, 자이리톨의 광질 이탈 억제작용, 자이리톨배합 구강환경관리용품 및 자이리톨배합껌의 효과에 관한 연구 보고 등이 있다(35,38-41). 본 연구에서는 24시간 후에도 죽염혼합물 A, B, C 첨가군에서 7.11～7.15로 나타나 우식임계 pH에 도달하지 않았으며, S. mutans의 성장을 저해하였다.
이상의 결과를 종합해 보면 죽염 단독으로 사용할 때보다 송진, 죽엽, 프로폴리스 및 자이리톨 혼합물은 치아우식균인 S. mutans의 성장과 산생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 치아우식증 및 치주염에 예방에 사용되고 있는 기존의 방법을 보완할 수 있는 치아우식증 및 치주염 예방제 개발가능성이 높은 것으로 생각된다.
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죽염혼합물이 Streptococcus mutans의 성장 및
산 생성에 미치는 영향
유용욱, 유현희
원광대학교 치과대학 구강생화학교실
Effects of Bamboo Salt and Bamboo Salt Mixture on the growth, acid production of Streptococcus mutans
Yong-Ouk You, Hyeon-Hee Yu
Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Wonkwang University, Iksan, 570-749
Abstract
We studied the inhibitory effect of the bamboo salt mixtures (Bams) on the growth and acid production of Streptococcus mutans (S. mutans). The growth of S. mutans was reduced by the presence of the Bam A (1mg/ml), Bam B (1mg/ml), Bam C (1mg/ml), and NaCl (1mg/ml) significantly
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, and the positive control group (1% of NaF) also exhibited antibacterial activity. However, the bamboo salt alone did not exhibit antibacterial activity significantly. The decrease of pH was significantly inhibited in the presence of Bam A (1mg/ml), Bam B (1mg/ml), and Bam C (1mg/ml) compared to the control group
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박사논문-cell proliferation
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. The decrease of pH was also inhibited in the presence of positive control group (1% of NaF), but the Bamboo salt alone did not demonstrate the inhibitory activity. These results suggest that Bams may have inhibitory effect on the growth and acid production of S. mutans
Keywords : bamboo salt; bamboo salt mixture; Streptococcus mutans
♯To whom all correspondence should be addressed
Tel: 82-63-850-6926 Fax:82-63-850-7313
E-mail:hope7788@wonkwang.ac.kr
치아우식증은 치과영역에서 가장 흔한 만성질환으로 알려져 있다. 치아우식증은 법랑질, 백악질, 상아질등과 같은 아의 경조직이 점차 비가역적으로 파괴되는 질환으로서 일반적으로는 충치라고 알려져 있다(1).
치아우식증은 전 세계적으로 널리 만연된, 사람이 치아를 사람이 치아를 상실하는 대표적인 원인질환으로서 당섭취 증가와 평균수명이 늘어남에 따라 발생이 증가하는 추세이므로 그 효과적인 관리대책이 절실히 요구되고 있다(2-4). 치아우식증의 주된 원인은 치면세균막에 의하여 유발되는데, 치면세균막에는 많은 함량의 미생물이 존재하는 것으로 알려져 있다. 치면세균막내 미생물은 당질을 대사하여 유기산을 형성함으로 치아의 경조직을 파괴하는 것으로 보고된 바 있다. 치아우식증은 전 세계적으로 널리 만연된, Streptococcus mutans (S. mutans)는 치면세균막형성에 가장 중요한 역할을 하는 원인균으로 알려져 있으며, S. mutans는 치아우식을 일으키는 주요 원인균으로 주목받고 있다(5,6). S. mutans는 G(+) 통성 혐기성세균으로 구강내의 치면세균막에 상주하여 섭취한 음식물에 포함된 탄수화물, 특히 포도당, 과당 등을 분해하고 그 대사과정에서 발생하는 부산물인 유기산 주로 젖산을 세포외로 방출함으로써 치아 법랑질을 탈회시킨다(7).
치아우식증 예방을 위해 치면세균막 형성의 원인균을 퇴치에 penicillin과 erythromycin 같은 항생제가 효과적인 역할을 하는 것으로 보고된 바 있지만, 장기간의 사용시 항생제에 대한 내성이 발생하므로 인해 임상에서 사용되지 못하고 있다(8). 또한 불소 화합물의 이용법(9-11)도 치면세균막 형성 억제에 쓰이고 있으나, 80 ppm이상의 농도로 사용시 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있다(12). 그 외 몇몇 구강세정제 등이 치아우식예방을 위한 약제로 개발되어 왔으나(13), 아직까지도 치아우식증이 주요한 치아상실의 원인으로 부각되는 것은 이러한 약제들이 충분한 효과를 거두지 못하고 있다는 증거이다. 따라서 보다 효과적이고, 실용적이며, 안정성이 있는 치아우식증 예방제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
지금까지의 연구에 따르면 몇몇 천연물이 치아우식증 예방에 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다. 죽염은 치아우식증 예방에 효과적인 천연물로 전통의학에서 널리 사용되어 왔고, 현재에도 세치제 및 구강세정제로 사용되고 있는 형편이다. 또한 송진, 죽엽, 프로폴리스 및 자이리톨도 구강질환 예방제로 쓰여왔다.
따라서 본 연구에서는 죽염 및 송진, 죽엽, 프로폴리스 또는 자이리톨이 함유된 죽염혼합물이 S, mutans의 성장 및 산생성 억제에 미치는 효과를 관찰하여, 전통의학에서 치아우식증 예방에 사용되어온 죽염 및 죽염복합물의 효능을 과학적으로 입증하고, 더 나아가서 치아우식증에 예방에 사용되고 있는 기존의 방법을 보완할 수 있는 치아우식증 예방제를 개발시도 하고자 한다.
실험재료 및 방법
균주 및 배양
본 실험에 사용한 균주인 Streptococcus mutans ATCC 10449로, Brain heart infusion (Difco, USA)액체배지에 1-2차 계대배양 후 같은 배지에 식균하여 37℃의 항온기에서 24시간 배양하여 사용하였으며, 각 균주 배양액의 탁도를 탁도0.5관 (McFarland 0.5)으로 맞춘 다음 사용하였다.
죽염혼합물의 준비
효과적으로 항균 활성을 나타내는 죽염혼합물을 탐색하기 위하여 송진, 죽엽, 프로폴리스 또는 자이리톨을 이용하여 죽염혼합물 A, B, C를 제조하였다. 죽염혼합물 A의 조성은 죽염 55%, 송진 35% 및 자이리톨 10%가 함유되었고, 죽염혼합물 B의 조성은 죽염 66.7%, 송진 33.2% 및 죽엽 0.1%가 함유되었으며, 죽염혼합물 C의 조성은 죽염 55%, 송진 35%, 자이리톨 14% 및 프로폴리스 1%가 함유되었다.
항균 활성 측정
죽염 및 죽염혼합물 등의 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지(1% Glucose 함유)에 죽염 및 죽염 혼합물, NaCl, 등을 1 mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후 시험관에 0.95ml씩 분주한 다음 S. mutans를 0.05 ml 넣은 후, 37oC incubator에서 24시간 배양한 후 spectrophotometer로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세균 배양액을 연속희석하여 MSBA 고체배지에 도말한 후 37oC incubator에서 48시간 배양후 colony forming unit(CFU)를 계산하였다. 이때 1% NaF를 양성 대조군으로 사용하였다.
산 생성량 측정
죽염 및 죽염혼합물 등의 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지(1% Glucose 함유)에 1 mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후 시험관에 0.95ml씩 분주한 다음 S. mutans를 0.05 ml 넣은 후, 37oC incubator에서 24시간 배양한 후, pH meter를 이용하여 pH를 측정하였다.
실 험 결 과
죽염 및 죽염혼합물의 항균활성
죽염 및 죽염혼합물의 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지(1% Glucose 함유)에 각 시료를 1mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후 24시간 배양하여, 흡광도를 측정한 결과, 죽염혼합물 A, B, C, NaCl, NaF는 대조군에 비해 유의적인 차이를 보였고(p<0.01～0.001), 죽염은 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 측정된 OD값은 대조군에 대한 상대 성장률로 산정한 결과 죽염 99.30%, 식염 61.97%인 반면 죽염혼합물 A, B, C는 각각 5.21%, 2.16%, 9.51%로 S. mutans의 성장을 현저하게 억제되었다(Table 1).
Table 1. Effect of bamboo salt mixture on optical density of S. mutans ODa % of controlControl0.59±0.007 A (1mg/ml)0.03±0.006**C 5.21±1.12**B (1mg/ml)0.01±0.02** 2.16±3.05**C (1mg/ml)0.06±0.005** 9.51±3.13**Bamboo salt (1mg/ml)0.58±0.006 99.30±1.00NaCl (1mg/ml)0.36±0.007* 61.97±1.39*1% NaF0.004±0.005** 0.70±0.78**aOptical Density at 540 nm, Values are expressed as the mean±SD, (n=10).
*p<0.01 Significantly different from control group by t-test
**p<0.001 Significantly different from control group by t-test
MSBA 고체배지에 도말한 후 37oC incubator에서 48시간 배양후 colony forming unit를 계산한 후, 대조군에 대한 상대 성장률로 산정한 결과, Table 1과 마찬가지로 죽염혼합물 A, B, C의 1mg/ml 농도에서 S. mutans의 성장 억제 효과가 현저하였다(Table 2).
Table 2. Effect of bamboo salt mixture on colony forming unit of S. mutans CFUa % of ControlControl1.60×108±0.26A (1mg/ml) 0±0.00* 0±0.00*B (1mg/ml) 0±0.00* 0±0.00*C (1mg/ml) 0±0.00* 0±0.00*Bamboo salt (1mg/ml)1.44×107±0.08* 8.99±0.55*NaCl (1mg/ml)1.03×105±3.42* 0.06±0.02*1% NaF2.20×10±8.16* 0.01±0.00005*aColony forming unit, Values are expressed as the mean±SD, (n=10).
*p<0.001 Significantly different from control group by t-test
죽염 및 죽염혼합물의 산생성 억제효과
S. mutans에 의해 생성되는 유기산은 치아우식증에 직
접적인 영향을 미치는 중요한 요인이다. Table 3의 결과를 보면 죽염혼합물 A, B, C 및 양성대조군인 NaF처리군에서 S. mutans의 산 생성이 유의적으로 억제됨을 알 수 있었다. 그러나 NaCl 및 죽염 처리군에서는 산생성 억제효과가 나타나지 않았다.
Table 3. Effect of bamboo salt mixture on acid production by S. mutans SamplepHaControl3.98±0.09A (1mg/ml)7.14±0.06*B (1mg/ml)7.15±0.06*C (1mg/ml)7.11±0.07*Bamboo salt (1mg/ml)3.94±0.10NaCl (1mg/ml)3.96±0.111% NaF7.03±0.02*aValues are expressed as the mean±SD, (n=10).
*p<0.001 Significantly different from control group by t-test 고 찰
치아우식증은 구강 내에 생존하는 200여종의 미생물 중 S. mutans를 비롯한 구강질환 유발균들이 생성하는 불용성글루칸과 미생물들 그리고 음식물 잔사등이 서로 엉켜, 치면에 치태라고 하는 치면세균막을 형성하고 이들 미생물들의 대사산물인 각종 산에 의해 구강내 pH를 5.5이하로
낮추어 치아의 법질층의 무기질 성분들이 탈회되어 발생하는 질환이다2). 1980년대 중반부터는 전통약제나 식물 등에서 치아우식을 억제하는 효과를 밝히려는 일련의 시도들이 있어 왔다. 이에 본 연구에서는 죽염 및 송진, 죽엽, 프로폴리스 또는 자이리톨이 함유된 죽염혼합물의 S. mutans에 대한 성장과 산 생성 억제 효과를 측정하였다.
그 결과를 보면 A(죽염:송진:자이리톨=55:35:10), B(죽염:송진:죽엽=66.7:33.2:0.1), C(죽염:송진:자이리톨:프로폴리스=55:35:14:1), 죽염, NaCl 각 시료를 1mg/ml의 농도로 각각 첨가한 후, S. mutans를 24시간 배양하여, 흡광도를 측정한 결과, A, B, C는 대조군에 비해 각각 5.21%, 2.16%, 9.51%의 상대 성장률을 보여, S. mutans의 성장을 현저하게 낮추었다(p<0.01). 반면, 죽염은 99.30%, 식염은 61.97%였다. 그리고, MSBA 고체배지에 도말한 후 48시간 배양 후 colony forming unit를 계산한 결과에서도 A, B, C는 1mg/ml 농도에서 S. mutans의 성장이 완전히 억제 되었으며(p<0.001), 식염과 죽염은 각각 8.99%, 0.06%의 상대 성장률을 보였다.
일반적으로 미생물 배양시 각 미생물은 탄소원을 자화하여 성장에 필요한 에너지와 중간대사산물로 이용한다. 이 과정에서 유기산이라는 노폐물이 축적되어 배지의 수소이온농도를 증가시키고 즉 pH를 떨어뜨린다(2). 특히 S. mutans에 의해 생성되는 유기산은 치아우식증에 직접적인 영향을 미치는 중요한 요인인데, 대조군에서 pH는 3.98인 반면, 죽염혼합물 A, B, C 첨가군에서 각각 7.14, 7.15, 7.11로 나타나 S. mutans의 산 생성이 유의적으로 억제되었으며(p<0.001), 이것은 양성대조군인 1% NaF처리군의 7.03과 비슷한 결과였다. 이에 비해, 죽염과 식염은 각각 3.94, 3.96으로 나타났다. 즉, 죽염혼합물첨가로 S. mutans의 성장 뿐만 아니라 대사과정이 억제되어 산 생성량이 감소된 것에 기인한 것으로 보인다.
식염이 세균에 대해 증식을 억제하거나 살균 효과를 나타내는 것은 주로 삼투압의 작용에 의한 것이라고 볼 수 있다(14). Takada와 Fukushima(15)는 2% 식염 농도에서 다종의 S. mutans의 증식은 억제되었으나, 치태형성에 관여하는 효소인 glucosyltransferase activity는 균 종류에 따라 서로 다른 결과를 가져 왔다고 하였다. 정(16)은 자당 용액에 저농도(2.7%)의 식염을 첨가한 경우 S. mutans에 의한 자당발효에는 영향을 미치지 않았으나 증식을 상당히 억제 하였다고 하였다. 죽염은 식염(천일염)을 대나무 속에 넣어 고온으로 가열하여 태우기를 여덟 번 반복한 후, 마지막으로 아주 고온으로 녹여 흘러내린 것을 빻아서 제조한 일종의 가공식염으로서(14), 금속원소 중 K, Ca, Fe, Zn, Mn의 함량이 높을 뿐 아니라 알칼리성(pH 10) 물질이다(17). 이러한 죽염은 우리나라에만 특이하게 전해되어 오는 민간요법으로 구내염, 치통, 설암, 구강암 등 구강질환 치료와 위염, 위산과다, 위궤양, 위암, 축농중, 중이염 등 매우 다양한 질환의 치료에 이용되었다(16). 또한 구강내 세균증식을 억제시키며, 치태억제 및 치은염 감소에 효과가 있다(14,18-22)고 보고 되고 있으며, 허 등(17)은 마늘-죽염 제제가 위장 장애에 대한 방어효과와 치료효과를 나타내었다고 하였다. 그러나 양 등(23)은 실험동물에서 항암, 항고혈압 및 항당뇨 효과를 나타내지 않았으며, 김 등(24)은 항위궤양 효과를 기대하기 어렵다고 보고하였다. 죽염의 경우에는 균 증식을 억제함에 있어서 삼투압 이외에 제조과정에서 첨가된 무기이온의 상호작용 및 높은 pH도 상당한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(16). 그러나 본 연구에서는 식염과 죽염을 각각 단독으로 사용한 것에 비하여 송진, 죽엽, 자이리톨 및 프로폴리스를 혼합한 것이 월등히 효과가 좋은 것으로 나타나 이러한 물질의 상호작용에 의한 억제 효과가 있는 것으로 보인다.
송진은 소나무와 같은 속 식품의 줄기에서 나오는 진으로 많은 양의 수지산과 α-피텐, β-피넨, 캄펜과 같은 정유, 쓴맛 성분인 피니피크린, 탄닌, 비타민 등이 들어있다(25). 동의보감(26)에는 모든 악창(惡瘡), 두양(頭瘍), 백독(白禿), 개소(疥瘙)를 주로 치료하고 사기(死肌)를 없애며 귀가 먹은 것과 충치를 치료한다고 기록되어 있다. 의방유취(27)에는 벌레가 먹은것처럼 이가 삭아 구멍이 생기면서 아픈 것을 치료하는데 쓰이며, 동약법제, 북한동의보감에는 염증, 악창, 옴, 습진 등 외용약으로 사용하였다고 한다(25,28).
죽엽은 대나무의 잎을 가리키며 열내림, 피멎이약, 중풍, 고혈압 등에 민간 요법으로 사용되어 왔고(29), 살균 및 항진균 작용과 항암효과, 지질과산화물 억제, 전자공여능, 아질산염 제거능 등의 생리활성도 있는 것으로 알려지고 있다(30).
그러나 송진과 죽엽의 치아우식 및 치의학 분야에 대한 연구 보고는 미흡한 실정이다. 본 연구에 의하면 죽염, 송진, 죽엽의 혼합물이 다른 혼합물에 견주어 볼 때 그 효과가 떨어지지 않는 것으로 보아 추후 송진과, 죽엽 각각의 연구도 필요하리라 생각된다.
프로폴리스는 꿀벌이 식물로부터 수지(樹脂)를 수집하고 이를 저작(詛嚼)하는 동안 분비한 타액과 복부로부터 분비되는 beewax를 섞어 만드는 물질이다(31). Propolis용액은 S. mutans와 구강에서 분리한 다른 세균에 대해 항균효과를 나타내어 치아우식을 억제한다(32)고 연구되고 있다. 현재 북구와 동구권에서는 프로폴리스의 항균, 방부, 수렴, 정균, 진경, 소염, 마취효과 등 그 동안의 연구 결과에서 나타난 효과들을 이용하여 치약성분, 화장품, 건강식품 등으로 광범위하게 이용하고 있다(33,34).
자이리톨은 식물에서 추출한 D-xylose를 수소화하여 생산하는 5탄당 알코올로, 자당과 같은 정도의 단맛을 내는 물질로서, 용해열이 커서 구강상쾌감을 나타낸다. 자이리톨은 40개국 이상에서 식품첨가 감미료나 미용제 또는 약제로 사용되고 있다(35). 구강내 세균에 대한 자이리톨 연구를 보면 이 등(36)
[숨은설명:시작]
김윤정, p15
[숨은설명:끝]
은 S. mutans를 100 mM 자이리톨이 첨가된 BHI에 배양했을 때 균 성장은 포도당, 과당 또는 솔비톨을 첨가하고 배양했을 때에 비해 1/2정도 억제 되었고, 배양물의 pH 저하 등 자이리톨이 첨가된 BHI 배양액에서 가장 낮게 나타났으며 포도당과 함께 배양했어도 자이리톨이 첨가되면 균 성장과 pH 저하도 자이리톨의 영향으로 억제 되었다고 보고하였다. 또한 박(37)은 자이리톨(0.5%)이 S. mutans에 의해 8시간 동안에 우식임계 pH 5.5에 도달되지 않았으며, S. mutans의 성장을 저해하였다고 하였다. 또한 자이리톨과 불소의 복합작용, 자이리톨의 광질 이탈 억제작용, 자이리톨배합 구강환경관리용품 및 자이리톨배합껌의 효과에 관한 연구 보고 등이 있다(35,38-41). 본 연구에서는 24시간 후에도 죽염혼합물 A, B, C 첨가군에서 7.11～7.15로 나타나 우식임계 pH에 도달하지 않았으며, S. mutans의 성장을 저해하였다.
이상의 결과를 종합해 보면 죽염 단독으로 사용할 때보다 송진, 죽엽, 프로폴리스 및 자이리톨 혼합물은 치아우식균인 S. mutans의 성장과 산생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 치아우식증 및 치주염에 예방에 사용되고 있는 기존의 방법을 보완할 수 있는 치아우식증 및 치주염 예방제 개발가능성이 높은 것으로 생각된다.
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첨부등록일 2009.12.21 02:59
